人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA Kit

【實驗方法】雙抗體夾心法

【種屬】人

【檢測范圍】 見說明書

【檢測波長】450 nm

【樣本類型】血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本

【反應時間】 1.5~2h

人腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫分析(ELISA) 試劑盒使用說明書 貨號：JYM0110Hu ? 本試劑盒僅供科研使用。 ? 本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體 樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。 ? 有效期：6個月 ? 保存條件：2-8℃

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的 人腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次 加入腫瘤壞死因子α(TNF-α)，再與HRP標記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結合，形 成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下 轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成很終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子 α(TNF-α)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算 樣品中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。

試劑盒組成

樣本處理及要求 1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細 收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。 2. 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離 心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應 該再次離心。 3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存 過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。 4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液， 細胞濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離 心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應 再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保 存備用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或 勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。分 裝后一份待檢測，其余冷凍備用。 6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能 馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融. 7. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在第一、第二孔中分別加 標準品 100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從第一 孔、第二孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準 品稀釋液 50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻； 混勻后從第五、第六孔中各取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔 中分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、 第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各 取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，濃度分別為 300 pg/ml,200 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml , 25pg/ml）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測 樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品很終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕晃動混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標試劑 50ul，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。 5. 配液：將 30(48T 的 20 倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30(48T 的 20 倍)倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如 此重復 5 次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50ul，再加入顯色劑 B50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯 色 10 分鐘.

8. 終止：每孔加終止液 50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 9. 測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終 止液后 15 分鐘以內進行。 注意事項 1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如 未用完，板條應裝入密封袋中保存。 2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。 3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間很 好控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 4. 請每次測定的同時做標準曲線，很好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定， 計算時請很后乘以總稀釋倍數（×n×5）。 5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6. 底物請避光保存。 7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準. 8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 9. 本試劑不同批號組分不得混用。 10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。 計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標， 在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋 倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能 1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數 R 值為 0.92 以上。 2.批內與批間應分別小于 9%和 15% 檢測范圍： 5pg/ml -400pg/ml

上海寶葉生物科技有限公司

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